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1、PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局 PCR擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室原則上分為四個單獨(dú)的工作區(qū)域：試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。為避免交叉污染，進(jìn)入各個工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。 2、實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制 PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。 2.1 PCR試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū) 該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。 對與氣流壓力的控制，本區(qū)并沒有嚴(yán)格的要求。 2.2 PCR標(biāo)本制備區(qū) 該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測定DNA的合成本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎海员苊鈴泥徑鼌^(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動。 2.3 擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū) 該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板 (來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。 本區(qū)的壓力梯度要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動。個別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺內(nèi)進(jìn)行。 2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測定本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對本區(qū)的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。 3、污染的預(yù)防與控制 PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。 3.1 工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分 （1）各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理； （2）各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。 3.2 合理的系統(tǒng)設(shè)置 （1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)； （2）嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。 3.3 規(guī)范的操作 （1）擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的工作； （2）在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施； （3）清潔工作及時、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對本區(qū)進(jìn)行清潔。除常規(guī)的消毒液體對表面進(jìn)行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)進(jìn)行高壓消毒處理。 3.4 嚴(yán)格的管理 （1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個實(shí)驗(yàn)區(qū)的門； （2）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。 （3）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等； （4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。 3.5 完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施 完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機(jī)、加樣器等。 |
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